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Core Facility
FLOWCYTOMETRY
용도와 배경
생체의 기관, 조직은, 다양한 세포에 의해서 구성되어 있다. 예를 들면, 성체의 조혈의 장소인 골수는, 조혈간세포(hematopoietic stem cell), 골수구계 선구 세포
(myeloid progenitor), 임파구계 선구 세포(lymphoid progenitor), 호중구(neutrophil), 단구(monocyte), 탐식 세포(macrophage), B임파구(B lymphocyte),
T임파구(T lymphocyte), NK세포, NK T세포, 적혈구(erythrocyte), 거핵구(megakaryocyte) 등의 혈액 세포, 한층 더 혈관을 구성하는
혈관내피세포(endothelial cell), 조직의 구축에 관련되는 간질계의 세포군(stromal cell) 등매우 heterogeneous 세포군에 의해서 구성되어 있다.
이와 같이 복잡한 조직중에서 형태학적으로 목적의 세포를 분류 분리하는 것은 거의 불가능하다. 또, 종래 단일(homogeneous) 세포 집단이고라 생각 되온
암의 종류도 heterogeneous 세포군에 의해서 구성되어 있어 cancer stem cell의 존재 여부와 세포에 따라서 항암제의 감수성이 다른 것이 밝혀져 왔다.
근년 stem cell biology가 많은 연구자의 주목을 끌고 있지만, stem cell는 매우 소수의 세포 집단(minor population)이며, 그 분류 분리를 위해서는
특이적인 마커(specific marker)로 세포를 표지 하는 것이 필수적이다.
게다가 개개의 세포의 분화 단계, 활성화 상태를 측정하는 것은, 세포에 고유한 기능을 조사하기 위해 매우 중요하다. 세포 표면의 분자의 측정에 머물지 않고,
세포를 고정해, 세포내의 분자의 활성화 상태나 DNA 상태에 대해 측정하는 여러가지 기술도 개발 되고 있다.
이상과 같은 연구를 수행하기 위한 기초적 기술로서 Flowcytometry가 개발되었다.
보유장비
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Guava EasyCyte Plus
- · Four-colour fluorescence (6 parameters) capability
- · Cell counter
- · Low running cost
- · Easy handling
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FACSCalibur
- · Lasers; 488, 635 nm
- · Four-colour fluorescence (6 parameters) capability
- · Acquiring speed: 3,000 events/sec
- · Cell Quest Pro software
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LSR II
- · Lasers; 355 (UV), 488, 405, 633 nm
- · Up to 10-colour fluorescence (12 parameters) capability
- · Acquiring speed: 10,000 events/sec
- · FACSDiva software
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FACSAria II
- · Lasers; 375 (nearUV), 488, 633 nm
- · Up to 9-colour fluorescence (11 parameters) capability
- · Acquiring speed: 30,000 events/sec
- · FACSDiva software
- · Fixed alignment of the flow cell and lasers
- · Sorting 4 populations
원리
수류계(fluidics), 광학계(optical system: lasers, photodetector), 전기계(electricity, detecteor/transducer), 분취계(sorting)로 구성된다. 측정 대상으로
하는 시료의 세포를 한 개 한 개 일렬에 늘어놓아 레이저광(laser)으로 조사해, 발생한 산란광(scatter)과 형광(fluorescence)을 측정, 전기적 신호로 치환한다.
세포 분리가 필요한 경우는 sorting 기능을 이용한다.
제품설명
현재 여러가지 회사가 Flowcytometry를 개발, 판매하고 있다. 그 중에서도 선구자인 Becton Dickinson 사의 제품은 성능이 뛰어난 것으로 정평이 나있어,
세계 표준이 되고 있으며, 미국 National Institutes of Health에서도 Flowcytometry Core Facility의 기기는 모두 Becton Dickinson 사 제품이다.
분석기로서는, 조작, 유지가 간편하고, 4색, 6 parameters까지 측정 가능한 FACSCalibur, 최대 18색, 20 parameters까지 측정가능한 최신 기종 LSR II,
sorter로서는, 최대 15색, 17 parameters로 분석, 분취 가능한 FACSAria를 구입 희망이다.
FLOWCYTOMETRY에 의해서 진전이 기대되는 연구 분야
기기의 개발 당초부터 범용되어 온 Hematology, Immunology의 분야 뿐만 아니라 Stem cell biology, Oncology, Endocrinology/Metabolism, Microbiology 등, 모든 생물학적 연구 분야에 있어 기본적인 기술이다.
유지, 사용 비용(maintenance/running cost)
Core Facility의 technician 3명이 유지 관리에 책임을 진다. 특히 sorter는 청결 조작, 청결 관리가 중요하고, 실험 결과에 영향을 주기 위해, 책임자를 복수명 두는
유지 관리 시스템이 필수이다. Sorter에 대해서는 1 시간당 20 달러 정도의 running cost가 걸린다. .
데이터 해석(data analysis)
Becton Dickinson 사의 기기는 FACSDiva로 불리는 소프트웨어로 데이터를 취득, 해석한다. 데이터의 사이즈가 방대하고, 상세한 데이터 해석에 시간을 필요로
하기때문에, 개개의 실험자는 데이터를 즉시 가지고 돌아가, 실험자가 보존, 해석할 필요가 있다. 해석 소프트웨어로서는 TREE STAR 사제의 FLOWJO가 최적이고,
연구소의 모든 컴퓨터에서 사용할수 있게 계약하는 것이 바람직하다. 이 시스템은 미국 National Institutes of Health에서 사용되고 있다.