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  Flowcytometry 용도 배경

생체의 기관, 조직은, 다양한 세포에 의해서 구성되어 있다. 예를 들면, 성체의 조혈의 장소인 골수는, 조혈간세포(hematopoietic stem cell), 골수구계 선구 세포(myeloid progenitor), 임파구계 선구 세포(lymphoid progenitor), 호중구(neutrophil), 단구(monocyte), 탐식 세포(macrophage), B임파구(B lymphocyte), T임파구(T lymphocyte), NK세포, NK T세포, 적혈구(erythrocyte), 거핵구(megakaryocyte) 등의 혈액 세포, 한층 더 혈관을 구성하는 혈관내피세포(endothelial cell), 조직의 구축에 관련되는 간질계의 세포군(stromal cell) 등매우 heterogeneous 세포군에 의해서 구성되어 있다. 이와 같이 복잡한 조직중에서 형태학적으로 목적의 세포를 분류 분리하는 것은 거의 불가능하다. 또, 종래 단일(homogeneous) 세포 집단이고라 생각 되 온 암의 종류도 heterogeneous 세포군에 의해서 구성되어 있어 cancer stem cell의 존재 여부와 세포에 따라서 항암제의 감수성이 다른 것이 밝혀져 왔다.

근년 stem cell biology가 많은 연구자의 주목을 끌고 있지만, stem cell는 매우 소수의 세포 집단(minor population)이며, 그 분류 분리를 위해서는 특이적인 마커(specific marker)로 세포를 표지 하는 것이 필수적이다.
게다가 개개의 세포의 분화 단계, 활성화 상태를 측정하는 것은, 세포에 고유한 기능을 조사하기 위해 매우 중요하다. 세포 표면의 분자의 측정에 머물지 않고, 세포를 고정해, 세포내의 분자의 활성화 상태나 DNA 상태에 대해 측정하는 여러가지 기술도 개발 되고 있다.

이상과 같은 연구를 수행하기 위한 기초적 기술로서 Flowcytometry가 개발되었다.

 
  Confocal 현미경의 용도

생체조직과 세포의 구조와 단백질을 실시간으로 관찰할 수 있으며, 생체조직에 손상을 최소화하면서 3차원적 세포 및 조직의 단면에 대한 정보를 얻을 수 있다. 또 고정된 조직 혹은 살아 있는 세포를 실시간으로 관찰할 수 있고 다형광 표지를 통한 단백질 분포 양상 관찰은 물론 단백질의 화학적 변화를 감지할 수 있다.

 
  보유장비
Analyzers

Guava EasyCyte Plus
· Four-colour fluorescence (6 parameters) capability
· Cell counter
· Low running cost
· Easy handling
FACSCalibur
· Lasers; 488, 635 nm
· Four-colour fluorescence (6 parameters) capability
· Acquiring speed: 3,000 events/sec
· Cell Quest Pro software
LSR II
· Lasers; 355 (UV), 488, 405, 633 nm
· Up to 10-colour fluorescence (12 parameters) capability
· Acquiring speed: 10,000 events/sec
· FACSDiva software

Sorter

FACSAria II
· Lasers; 375 (nearUV), 488, 633 nm
· Up to 9-colour fluorescence (11 parameters) capability
· Acquiring speed: 30,000 events/sec
· FACSDiva software
· Fixed alignment of the flow cell and lasers
· Sorting 4 populations
 
  Confocal 현미경의 원리 및 장점

현재 의학,생물 연구 및 실험에 있어서 형광을 이용한 최신 실험 기법들은 논문 내용에 많은 부분을 차지하는 가장 필수적인 부분이다. 형광을 이용하여 얻을 수 있는 장점은 육안으로 관찰이 불가능한 단백질 및 바이러스의 발현위치를 이미지로 얻을 수 있고, 동시에 4가지의 서로 다른 색의 형광으로 각각 다른 단백질 및 세포 소기관등을 표지할 수 있어 정확하고 많은 정보를 동시에 얻을 수 있다. 또한 최근에 GFP(초록색 형광 단백질)가 의학 실험에 도입되면서 일반적인 고정 시료 뿐만 아니라 살아있는 세포 내에서의 특정 단백질 발현 및 위치 등을 실시간으로 분석할 수 있는 기법이 개발되어 있다. 그러나 기존 형광 현미경으로 시료를 검경하게 되면 선명하게 보이지 않아 정확한 결과 이미지를 얻는 것이 불가능하다.

Confocal 현미경은 레이저를 이용하여 시료의 한 부분(1 pixel)씩 만 여기 시키고 핀홀을 이용하여 정확하게 초점이 맞는 선명한 이미지 만을 취득하고 초점이 맞지 않는 부분은 제거 하여 특정 초점에서 고배율, 초고해상도 형광 이미지 결과를 얻을 수 있는 장비이다. 이에 전세계 그리고 국내에서도 논문에 첨부되는 형광이미지는 대부분 Confocal 현미경을 이용하여 제작하고 있고, 생물 의학 국제 저널 reviewer 들도 형광이미지 결과는 꼭 Confocal 현미경으로 제작하여 투고 하도록 강력하게 권장하고 있다. 또한 근래에 많은 개발이 진행되어 단위 시간 당 많은 이미지를 얻을 수 있어 생세포 형광 이미징(live cell imaging) 결과도 약 80% 정도는 Confocal 현미경을 이용하여 얻고 있다.

특히 암세포 및 당뇨 연구에는 세포부터 조직까지 다양한 시료의 형광 이미지 결과를 얻어야 하는데 이를 위해서 기존의 형광 현미경은 많은 제한이 있고, 결과 또한 정확하지 않기 때문에 위의 연구를 위하여 Confocal 현미경은 필수적인 장비라 하겠다.

 
  원리

수류계(fluidics), 광학계(optical system: lasers, photodetector), 전기계(electricity, detecteor/transducer), 분취계(sorting)로 구성된다. 측정 대상으로 하는 시료의 세포를 한 개 한 개 일렬에 늘어놓아 레이저광(laser)으로 조사해, 발생한 산란광(scatter)과 형광(fluorescence)을 측정, 전기적 신호로 치환한다. 세포 분리가 필요한 경우는 sorting 기능을 이용한다.

 
  제품설명

현재 여러가지 회사가 Flowcytometry를 개발, 판매하고 있다. 그 중에서도 선구자인 Becton Dickinson 사의 제품은 성능이 뛰어난 것으로 정평이 나있어, 세계 표준이 되고 있으며, 미국 National Institutes of Health에서도 Flowcytometry Core Facility의 기기는 모두 Becton Dickinson 사 제품이다.
분석기로서는, 조작, 유지가 간편하고, 4색, 6 parameters까지 측정 가능한 FACSCalibur, 최대 18색, 20 parameters까지 측정가능한 최신 기종 LSR II, sorter로서는, 최대 15색, 17 parameters로 분석, 분취 가능한 FACSAria를 구입 희망이다.

 
  Flowcytometry에 의해서 진전이 기대되는 연구 분야

기기의 개발 당초부터 범용되어 온 Hematology, Immunology의 분야 뿐만 아니라 Stem cell biology, Oncology, Endocrinology/Metabolism, Microbiology 등, 모든 생물학적 연구 분야에 있어 기본적인 기술이다.

 
  유지, 사용 비용(maintenance/running cost)

Core Facility의 technician3명이 유지 관리에 책임을 진다. 특히 sorter는 청결 조작, 청결 관리가 중요하고, 실험 결과에 영향을 주기 위해, 책임자를 복수명 두는 유지 관리 시스템이 필수이다. Sorter에 대해서는 1 시간당 20 달러 정도의 running cost가 걸린다.

 
  데이터 해석(data analysis)

Becton Dickinson 사의 기기는 FACSDiva로 불리는 소프트웨어로 데이터를 취득, 해석한다. 데이터의 사이즈가 방대하고, 상세한 데이터 해석에 시간을 필요로 하기때문에, 개개의 실험자는 데이터를 즉시 가지고 돌아가, 실험자가 보존, 해석할 필요가 있다. 해석 소프트웨어로서는 TREE STAR 사제의 FLOWJO가 최적이고, 연구소의 모든 컴퓨터에서 사용할수 있게 계약하는 것이 바람직하다.
이 시스템은 미국 National Institutes of Health에서 사용되고 있다.

 
 
 
 
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