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  소개

생명과학 분야의 괄목할 만한 발전과 현미경의 발달 사이엔 뗄 수 없는 중요한 관계가 있다
특히 공초점 레이저 주사현미경 (Confocal Laser Scanning Microscope: CLSM)은 레이저를 광원으로 하는 현미경으로 기존의 형광현미경에 비하여 이론적으로 1.4배 해상력이 월등한 영상을 얻을 수 있으며, 레이저를 사용하기 때문에 광 절편을 만들어 삼차원 영상을 관찰할 수 있으며, 생명과학분야에서는 살아 있는 시료를 대상으로 생리학적인 기능 연구에 대한 관심을 충족시킬 수 있는 필수적인 장비로써 생명과학분야에 없어서는 안될 현미경이다.

Confocal 현미경은 생체의 조직 내부의 삼차원 형상을 고해상도로 관측할 수 있게 되어 기초 의학의 발전에 지대한 공헌을 이루고 있다. 이밖에도 최근에는 HTS (High through put) 개념으로 많은 시료를 세포 수준에서 빠른 시간에 스크리닝 할 수 있는 기기로 개발되어 신약개발에 활용되고 있다.

공초점이란 한 점의 광원인 단일파장의 레이저를 조리개를 사용해서 시료의 초점과 맞지 않는 빛은 제거하고 초점과 일치하는 빛만을 검출기에 전달하는 기술로서, 레이저와 검출기가 하나의 초점을 공유하는 것이다.

공초점 레이저 주사현미경은 기존의 현미경과는 다르게 레이저를 광원으로 사용하여, 시료로부터 일정한 파장영역의 빛을 발광하도록 하며, 대물렌즈(Objective lens)를 지나 초점이 정확하게 맞는 빛 만을 검출기 조리개 (Detector aperture)로 분리한 후 민감한 검출기 (Photomultiplier tube: PMT)로 받아 디지털 신호화하여 컴퓨터로 전송하게 된다.

디지탈 영상을 구현할 때, 시료로부터 분산되거나 초점에서 벗어난 것들을 원래의 위치로 복원 (Resotoration) 하는 일련의 과정 중 Deconvolution 이란 방법이 있다. 대부분의 현미경들은 2차원 내에서는 정밀한 상을 얻을 수 있으나, 2차원 영상으로 3 차원 구조를 재 구성하게 되면 시료 내 빛의 분산과 초점을 벗어난 빛으로 인해 이미지 흐림이나 번짐 현상이 나타나게 된다. 이러한 이미지 흐림 현상은 현미경의 Point Spread Function (PSF) 에 의해 표본의 상이 뭉침으로써 일어나게 되는데 흐림 현상을 반복적으로 Deconvolution 과정을 통하여 제거하면 얻어진 상은 명확해지고 정량화 할 수도 있게 된다

 
  Confocal 현미경의 용도
생체조직과 세포의 구조와 단백질을 실시간으로 관찰할 수 있으며, 생체조직에 손상을 최소화하면서 3차원적 세포 및 조직의 단면에 대한 정보를 얻을 수 있다.
또 고정된 조직 혹은 살아 있는 세포를 실시간으로 관찰할 수 있고 다형광 표지를 통한 단백질 분포 양상 관찰은 물론 단백질의 화학적 변화를 감지할 수 있다.

Confocal Laser Scanning Microscope with ConfoCor3
(공초점 레이저 주사 현미경)

LSM510 / Carl Zeiss MicroImaging GmbH, 독일
 
  Confocal 현미경의 원리 및 장점
현재 의학,생물 연구 및 실험에 있어서 형광을 이용한 최신 실험 기법들은 논문 내용에 많은 부분을 차지하는 가장 필수적인 부분이다. 형광을 이용하여 얻을 수 있는 장점은 육안으로 관찰이 불가능한 단백질 및 바이러스의 발현위치를 이미지로 얻을 수 있고, 동시에 4가지의 서로 다른 색의 형광으로 각각 다른 단백질 및 세포 소기관등을 표지할 수 있어 정확하고 많은 정보를 동시에 얻을 수 있다. 또한 최근에 GFP(초록색 형광 단백질)가 의학 실험에 도입되면서 일반적인 고정 시료 뿐만 아니라 살아있는 세포 내에서의 특정 단백질 발현 및 위치 등을 실시간으로 분석할 수 있는 기법이 개발되어 있다.

그러나 기존 형광 현미경으로 시료를 검경하게 되면 선명하게 보이지 않아 정확한 결과 이미지를 얻는 것이 불가능하다.

Confocal 현미경은 레이저를 이용하여 시료의 한 부분(1 pixel)씩 만 여기 시키고 핀홀을 이용하여 정확하게 초점이 맞는 선명한 이미지 만을 취득하고 초점이 맞지 않는 부분은 제거 하여 특정 초점에서 고배율, 초고해상도 형광 이미지 결과를 얻을 수 있는 장비이다. 이에 전세계 그리고 국내에서도 논문에 첨부되는 형광이미지는 대부분 Confocal 현미경을 이용하여 제작하고 있고, 생물 의학 국제 저널 reviewer 들도 형광이미지 결과는 꼭 Confocal 현미경으로 제작하여 투고 하도록 강력하게 권장하고 있다. 또한 근래에 많은 개발이 진행되어 단위 시간 당 많은 이미지를 얻을 수 있어 생세포 형광 이미징(live cell imaging) 결과도 약 80% 정도는 Confocal 현미경을 이용하여 얻고 있다.
특히 암세포 및 당뇨 연구에는 세포부터 조직까지 다양한 시료의 형광 이미지 결과를 얻어야 하는데 이를 위해서 기존의 형광 현미경은 많은 제한이 있고, 결과 또한 정확하지 않기 때문에 위의 연구를 위하여 Confocal 현미경은 필수적인 장비라 하겠다.
 
  규격
Lasers 대부분의 형광물질에 대응하는 4가지 레이저 소스(사용파장 7가지)
Multi-Argon laser 458/477/488/514nm, 30mW
(적용가능 형광물질: CFP, GFP, FITC, Alexa 488, Cy2, YFP, Fluo-3, BCECF..)
HeNe laser 543nm, 1mW
(적용가능 형광물질 : Rhodamine, Cy3, Alexa 546, Texas Red, RFP, DsRed…)
HeNe laser 633nm, 5mW
(적용가능 형광물질: Cy5, Alexa 633…)
UV Diode 405nm, 30mW
(적용가능 형광물질 : DAPI, Hoechest, BFP, PA-GFP, KAEDE…)
위의 레이저들로 의학, 생물학 연구에서 사용되는 대부분의 형광물질을 여기시킬 수 있고 특히 UV laser 405nm의 경우,이 광원을 이용한 최신 실험기법들이 많이 개발되어 있는 상태이다.
Objectives 10x, 20x, 40x(water immulsion), 100x (oil immulsion for high magnification)
저배율부터 고배율까지 세포 및 조직의 고해상도 형광이미지를 얻을 수 있는 최상의 대물렌즈로 구성되어 있다.
Spectral Detection 3 confocal detectors with 3 independent piholes
고감도 광증폭기를 검출기로 사용하기 때문에 최소의 레이저 세기로 초 고감도의
형광 이미지를 얻을 수 있고, 각 검출기 마다 독립적인 핀홀이 장착되어 있어 다중
형광 이미징 시 가장 정확한 고해상도 이미지 제작이 가능하다.
투과광 detector 형광 이미지 뿐 만 아니라 투과광 이미지를 위한 별도의 광 검출기가 내장되어 있어 형광이미지와 투과광 이미지를 동시에 제작할 수 있다. 이는 특히 암세포 실험의 경우 세포의 형태를 반드시 보여줘야 하기 때문에 중요하다.
스캔 속도 살아있는 세포 형광 이미징이 가능한 빠른 속도- 1초당 5장의 이미지 획득 가능. Confocal 현미경을 이용한 생세포 이미징이 근래의 최대 이슈이므로 가급적 단위 시간 당 많은 이미지를 습득하는 것이 정확한 결과를 도출하는 데 중요하다.
Live cell 장비 세포 배양기와 동일한 조건을 현미경 제물대 위에서 구현하는 현미경용 세포 배양장치로 온도, 습도, CO2농도를 자동으로 조절하여 살아있는 상태의 세포를 장시간 관찰하는데 필수적인 부분이다. 특히 저산소환경 실험을 위한 O2 자동 조절 기능까지 장착되어 있어 암세포 및 당뇨 연구에 최상의 조건을 제공한다.
 
  용도
일반적인 Confocal 현미경의 용도는 다음과 같다.
다중 형광 염색한 세포 및 조직의 2차원 고해상도 고배율 이미징 및 정량분석
Confocal 현미경의 원리를 이용한 3차원 형광 이미징
투과광 검출기를 이용한 세포의 형태 분석 및 형광 이미지와의 대조 Confocal 현미경의 최신 기법은 다음과 같다.
GFP(초록색 형광 단백질)를 이용한 장시간 생세포 이미징(암세포의 변화관찰)
칼슘 인디케이터를 이용한 세포내의 칼슘 이온 이미징을 이용한 발암 및 암억제제 개발 연구
레이저를 이용한 특정 단백질의 자극 및 시간에 따른 변화 결과 분석
최신 형광 단백질인 PA-GFP및 KAEDE를 이용한 생세포 이미징
3차원 이미지를 시간 경과에 따라 제작하는 4차원 이미징
그외 생리학, 병리학, 약리학, 세포학 연구에 필요한 고해상도 고배율 형광 이미징
 
  결론
Confocal 현미경은 현대 의학 연구에 있어서 반드시 필요한 장비이며 이 장비를 이용하여 도출해낸 결과물들은 세계 유수의 저널에서 인정하듯이 상당히 신뢰도가 높다. 현재 이 장비를 대치할만한 장비는 아직 생산이 되고 있지 않으며 앞으로도 그 중요성은 더욱 증가 될 것이다.
 
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